Hallo lieve Lezers,
Vandaag heb ik niet zo veel te doen. Ik moet namelijk wachten op primers voor mijn experimenten, dus ik kan helaas nu even niet het lab op. En daarom ga ik jullie vandaag uitleggen wat primers zijn en hoe ik deze maak.
Een primer is een stuk DNA wat gebruikt wordt om een PCR mee uit te voeren. Het doel van een PCR is om DNA te kopiëren. De primer is het begin van de reactie. De primer is zo gemaakt dat zijn DNA precies overeenkomt met het begin van het DNA wat we willen kopiëren.
Hieronder zie je een plaatje als voorbeeld. Het paarse vlak geeft aan waar de primer zit en welke kant hij opgaat. Deze primer in het voorbeeld zit vlak voor een gen met Ampicilline resistentie en loopt naar rechts.
De primer bindt op het DNA en zal vanaf dan verder over het DNA "lopen". Bij elke nieuwe letter (A,T,G of C) wordt er weer een stukje DNA aangebouwd. Dit doet de primer totdat hij een nieuwe primer tegenkomt. Hieronder in de afbeelding zie je dat, het geselecteerde (grijze) gebied wordt hierin geheel gekopieerd.
Maar hoe maak ik nu dan primers? Nou allereerst ga ik kijken wat voor gen ik nodig heb, bijvoorbeeld het ampicilline resistentie gen. Dan open ik een programma: "Snapgene". Via dit programma kan ik allerlei soorten genen en plasmide bekijken. Ik zoek dan het juiste gen op en deze open ik. Omdat ik het hele gen wil ga ik voor en achter het gen een primer maken, zodat er genoeg ruimte aan beide kanten is om alles te kunnen kopiëren. Ik kan dan een combinatie van DNA maken (de A, T, G en C) die aansluit op het gen. Dit selecteer ik en via een paar stappen kan ik de selectie opslaan als primer. Nu is het vrij makkelijk om zomaar wat letters te selecteren, maar dat wil niet zeggen dat die combinatie werkt. Om een goede primer te hebben moet ik op een paar punten letten.
Die zijn als volgt:
- De primer is uniek en kan maar op 1 plaats van het gen binden.
- De primer, het paarse stuk, is het beste tussen de 17- 30 letters (A, T, G en C).
- De laatste letter van de primer is een G of een C.
- Aan het eind zijn er maximaal 2 G en C achter elkaar.
- AAAGCTCC is goed, AAGCTCCG is fout (Er is 3x een G en/of een C achter elkaar).
- De voor en achter primer kunnen niet met elkaar binden.
- De primer mag niet met zichzelf binden boven een bepaalde temperatuur (Hairpin structuur). Zie onderstaand plaatje voor een voorbeeld.
- De primer bindt bij een temperatuur tussen de 50 en 65 graden.
- De temperatuur voor binding van beide primers verschilt maximaal 4 graden. ( Voorbeeld: Primer 1 bindt bij 55 graden, dan moet primer 2 tussen de 51 en 59 graden binden).
- Van de primer is 35-55 % een G of een C.
Dit is ongeveer hoe ik een primer maak en waar ik op let bij het maken van primers. Natuurlijk is het altijd goed kijken en weet je nooit zeker of hij werkt totdat je hem test. Maar met bovenstaande stappen heb je in ieder geval een grote kans op goede primers.
Reactie plaatsen
Reacties